糖蜜酒精连续发酵的基本理论

(一)糖蜜酒精连续发酵的理论依据

糖蜜酒精连续发酵是在间歇法分批发酵的基础上发展起来的，但连续发酵的控制与分批发酵的控制毕竟有较大的差别。为了使糖蜜酒精连续发酵获得较高的发酵效率，必须首先认识在糖蜜酒精连续发酵过程中酵母生命活动的特点，另一方面要了解糖蜜酒精连续发酵的变化规律，要创造一个适宜于酵母糖蜜酒精连续发酵稳定状态的工艺条件。而这些稳定状态是建立在动态平衡的基础上。如果糖蜜酒精连续发酵出现不稳定性的问题，这不仅降低发酵率，同时会引起杂菌的污染和酵母菌种的变异，退化，甚至破坏正常连续发酵的进行。

正确设计糖蜜酒精连续发酵的工艺设备流程，首先要了解连续发酵过程中酵母的生长速度与发酵基质浓度，代谢产物浓度以及发酵基质流加速度，代谢产物形成速度的辩证关系，同时也要明确连续发酵的类型，合理选择发酵罐设备的大小、容量和数量；选择适宜的稀释度、进料速度、营养浓度和pH值等工艺参数，力求连续发酵处于动态平衡相对稳定的状态下进行。

糖蜜酒精连续发酵的类型大多是属于恒流速多级均质连续发酵系统，要认识恒流速多级均质连续发酵的变化规律，首先应分析最简单的连续发酵过程。从理论上仔细分析这一较简单的动态变化，并建立了数学关系式，通过数学关系式的理论推导，就不难看出连续发酵处于动态平衡相对稳定工艺参数之间的辩证关系。

(二)单级匀质连续发酵控制的理论依据

1．单级培养的基本概念

(1)稀释度的概念 酵母生长繁殖速度决定于发酵基质的浓度，而在发酵条件下发酵基质浓度却取决于稀释度和进料速度。

在恒流速匀质连续发酵罐中，单位体积的发酵醪在发酵罐中的平均停留时间是以稀释度D表示：

D＝f/V(小时-1)..............................................................1

式中 f——为发酵醪的速度，立方米／小时

     V——为发酵醪的容积即发酵罐的有效容积，立方米。

由此可以看出，所谓稀释度，即为每小时流过单位发酵罐的发酵醪容积数，单位为小时-1，也可以理解为每小时内新鲜基本稀糖液的交换量，稀深度的倒数即为停留时间。

∴停留时间 T＝1/D(小时)

例如表2—3所示。

(2)倍增时间或世代时间的概念 在分批发酵时，处于对数生长期的酵母，基本上以固定的速度繁殖。由于酵母是以二等分分裂法(出芽法)繁殖，细胞每分裂(出芽)一次所需要的时间为g，称为世代时间，又称倍增时间。假若在一定体积的发酵醪中，开始时酵母细胞数量为X0，经过一段培养后，细胞数量变化可写为：

末分裂(出芽)时，酵母细胞的浓度是X0

在第一次分裂后(一世代后)，酵母细胞浓度是2X0

在第二次分裂后(二世代后)酵母细胞浓度是2×2X0

在第n次分裂后(n世代后)，酵母细胞浓度是2n X0

即酵母经n次世代后最后的酵母细胞浓度为：

X=X0·2n.....................................................................2

n表示在t时间内细胞分裂的次数，则：

f/n=g......................................................................3

此g表示在对数生长期中平均世代时间或倍增时间，它在这里的含义是表示细胞群体的平均世代时间，并非某一个细胞繁殖的世代时间。直接测定平均世代时间是因难的，常采用的方法，是在一已知的时间间隔内测定细胞数量的增加，再经计算后求出平均世代时间，为此目的应将3写成n=t/g并代入2

则：X＝X0·2·t/g..............................................................4

将4式取对数并重排得到下列等式：

g=ln2·t/（lnx-lnX0）=0.69t/（lnX-lnX0）......................................5

等式5是计算世代时间的基本公式，它表示在t时间内，由二次测定菌体细胞数量的增加而计算出的平均世代时间。在测定时应在固定的条件下进行。

(3)对数生长速度的概念 在对数生长期中酵母的生长速度是固定的，对数生长期中一定时间内细胞数量的增加可用对数生长速度μ表示。

将4式取对数，则：1nx=t·ln2/g+lnX0...........................................6

因在对数生长期中ln2/g的数是固定的，如改用μ代替，上述等式可写为：

lnX＝μt+lnX0...............................................................7

则μ=ln2/g=0.69／g..........................................................8

或者将7式重排

μ=（lnX-lnX0）/t............................................................9

9式是测定对数生长速度的常用公式，它表示从t—t0这样时间间隔t内，菌体数量由X0增加到x时的速度。

对数生长速度μ是由酵母的生长能力和发酵的外界环境所决定的，酵母在对数生长期的生长速度μ要达到最大值必须生长在营养丰富的发酵醪中，也就是要含有充分的碳、氮、磷及生长因素，达到最大的生长速度称生长最高速度，以μm表示。

(4)菌体密度与生长速度的关系

x--发酵罐中酵母菌体密度，克／升

μ--对数生长速度，小时-1

从公式7去对数可得：

X=X0eμt....................................................................10

解此式可得酵母的瞬时增殖速度为：

dX/dt=μt...................................................................11

(5)生长速度与基质浓度的关系

μ=μmax·[S/（Ks+S）]........................................................12

式中 S——限制生长的基质浓度，克／升

 μmax——该发酵醪中μ的最大值即最高生长速度，小时-1

    Ks——生长速度等于最高生长速度一半时的基质浓度称饱和常数，克／升

μmax值的生理意义在于能说明在相同条件下，用作主要营养成分的发酵基质的同化效率，即说明酵母能利用该发酵基质的专门酶系统的活性高低。

Ks的生理意义是Ks数值的大小，表示酶系对发酵基质的亲和力，同时也表示该发酵基质在酵母细胞中的渗透能力的大小。

(6)总生长量的概念 酵母在一定容积的发酵醒醪中，繁殖所能达到的最大数量

G＝Km－X0..................................................................13

式中 Km——最终菌体量，克／升

xo——接种时酵母细胞的浓度，即接种量，克／升

G——总生长量，克／升

当酵母对数生长期结束，进入生长稳定期，此时细胞数量不再增加，因此生长稳定期的酵母数量就是生长量。

(7)限制因素的概念 如前所述，只有在某些限制因素出现后，酵母繁殖的对数生长期才会结束，常见的限制因素如营养物质的消耗，有毒代谢产物的积累、pH值的变化等，糖蜜酒精发酵中酒精代谢产物的积累对酵母就是一种限制因素。如果微生物生长时只有一种限制因素存在，如作为碳源或能源的主要营养成分成为限制因素时，那么总生长量G的数值便可以用来测定限制因素的影响，可作为研究微生物营养的工具，当其它营养物质是过量的，而只有一种主要营养成分是限量供应，成为该微生物生长的限制因素，这种微生物的总生长量G与此限制营养因素浓度之间的关系是一直线关系，可以表示为：

G＝KS0......................................................................14

式中 K-——产量常数

S0——限制营养因素的浓度，即消耗营养物质总量，克／升

G——总生长量，克／升

14式说明在此条件下，合成细胞数量是和限制因素的浓度成正比关系的，当限制因素——营养物质完全消耗尽，微生物生长也就完全停止。

根据14式可决定产量常数

K=G/S0.....................................................................15

上式说明，生长产量常数为消耗单位重量的营养物质所能生

成的菌体量，同时根据K值大小可以看出该微生物同化效率的高低。

2．连续发酵的生长动力学

(1)连续发酵时菌体密度的变化 在连续发酵罐中，酵母生长速度是：

dx/dt=μx

当连续加入新鲜基本稀糖液时，如酵母的生长速度为零，则发酵罐内的酵母菌体密度必然随稀释度而减少。

流出速度＝dx/dt=Dx.........................................................16

能建立连续发酵的基本条件，应是在连续发酵罐中处于动态

平衡状态，即对数生长速度等于稀释度μ＝D

酵母菌体增加速度=生长速度-流出速度＝0

即 dx/dt=μx－Dx=（μ－D）x=0................................................17

在17式中，可能出现三种情况：

① μ＞D，则在发酵罐中酵母菌体密度不断增加。

② μ＜D，则在发酵罐中酵母菌体密度不断减少。

③ μ=D， 则在发酵罐中酵母菌体密度成为动态平衡状态。

(2)连续发酵的发酵基质的变化

设： S0——流入时的基质浓度，克／升

S——流出时的基质浓度，克／升

因此S0＞S

连续发酵时基质变化也处于动态平衡状态，即基质增加速度=进入速度-流出速度-基质消耗速度＝0

ds/dt=DS0-DS-μmax·X/K[S/（Ks+s）]=0.........................................18

(3)连续发酵中平衡状态菌体密度与基质间的关系 从17和18式可见，在连续发酵的平衡状态下，菌体增加速度与基质增加速度都等于零，即：

dx/dt=0

ds/dt=0

因此能计算在连续发酵稳定状态下的x和s，计算x可变换18式为：

D（S0-S）=x/K·μmax·[S/（Ks+S）].............................................19

由于平衡状态下D=μ，

即 D=μmax·S/（Ks+S）

因此x＝K(S0-S).............................................................20

计算S可变换17式为：

X[μmax·S/（Ks＋S）－D]=0

同样由于 D＝μmax·S/（Ks＋S）

μmaxS=DKs＋DS

μmaxS－DS=DKs

S（μmax－D）=DKs

S＝DKs/（μmax－D）.........................................................21

根据21或18式可变为：

x=K{S0-Ks[D/（μmax－D）]}..................................................22

上面提到的Ks、μmas等的数值可通过分批发酵试验测定试验值，产量常数K也能测定试验值。根据以上数值，经21式及22式计算可得图2-3。

从图的曲线能说明基质浓度，对数生长速度或世代时间，发酵罐中酵母数量及流出的酵母数与稀释度之间的关系。

以上曲线根据下列数据计算：

μmax=1小时-1        K＝0.5

Ks＝0.2克／升       S0＝10克／升

从图2—3可以说明：

① 在相当大的稀释度范围内此类连续发酵是一个很稳定的系统，本身具有自我调节的能力，当给定任何一个稀释度，酵母能自动调整它自己而成为一动态平衡状态，此时发酵罐内酵母和发酵醪的浓度保持固定，只要流入的基本糖液的成分和流速保持不变，在这一平衡状态中酵母的生长速度必然相等于稀释度。

② 稀释度增大到一定范围以外，便达到临界稀释度Do，超出此范围，发酵罐中细胞数近似等于零，这种情况称为“冲出”，此时D＞μ，稳定状态遭到破坏，不能再维持连续发酵。

③ 稀释度介于0与Do之间有一最大产量(每单位时间单位体积的发酵醪中酵母细胞数量)的稀释度DM，此DM值是在接近“冲出”的条件下实现的，从图2-3可见酵母的产量曲线是由xF／V＝xD的曲线得到的。

(三)多级匀质连续发酵控制的理论根据

(1)糖蜜酒精连续发酵采用多级比单级有利，因为多级连续发酵可以比较充分地利用基质，而第一级发酵罐流出的发酵醪中未利用的基质，可以在以后的各级发酵罐内被继续消耗，因而多级连续发酵效率较高。其次是第一级发酵罐的酵母细胞数量立即达到对数生长期的数量，取消酵母繁殖中的迟滞期，使多级连续发酵一开始便进入主发酵阶段，从而取消了前发酵阶段，缩短了连续发酵过程的总时间，提高了设备利用率。

多级连续发酵是在一组几个串联的发酵罐中进行，第一级发酵罐中酵母的对数生长速度最高，在以后各级发酵罐中随着基质浓度的降低，相应发酵罐的对数生长速度也降低，为使各级发酵罐中有不同的生长速度及稀释度，因此各级发酵罐的体积必须适当调节。

(2)为了正确设计糖蜜酒精多级连续发酵的工艺设备流程，我们必须进一步了解多级连续发酵过程中的对数生长速度，稀释度，发酵体积及产率之间的相互关系及变化规律。

为了说明问题方便起见，主要讨论两级连续发酵，流程图见图2-4

说明：

第一级发酵罐体积V1，含有酵母菌体浓度X1发酵醪进入第一发酵罐的流速为F1，同时发酵醪流入第二级发酵罐的体积为V2，第二级发酵罐发酵醪流出的流速是F2，其中酵母菌体浓度为X2，第一级发酵罐的稀释速度为D1，第二级发酵罐的稀释速度为D2，并假定第二级发酵以F02的流速加入新鲜基本糖液，同时又从第一级发酵罐流入带有酵母细胞的发酵醪，则：

① 此第一级发酵罐中的动态平衡状态如同单级连续发酵一样，可写为D1＝μ1，然后未利用的基质以及酵母菌体流入第二级发酵罐，并被以流速F02流入的新鲜基质冲稀，离开第一级发酵罐时的酵母菌体浓度X1稀释为X02，可用下式计算得到：

X02=X1·F1/（F1+F02）.........................................................23

② 第二级发酵罐的稀释度

D2=F2/V2=（F1+F02）/V2

∵F1十F02=F2

第二级发酵罐的动态平衡状态必处于以下的均衡状态。

流入十生长＝流出

D2X02十μ2X2＝D2X2...........................................................24

将24式移项可以同样计算出D2的值

D2=μ2·X2/（X2-X02）.........................................................25

25式说明第二级发酵罐的稀释度D2是由该发酵罐对数生长速度和X2/（X2-X02）这一分数所决定的，试验条件决定X2/（X2-X02），因此第二级发酵罐的稀释度D2总是大于μ2，但是第二级发酵罐中的酵母菌体并不会过量流出，所以从24式可以推导出以下公式：

即在第二级发酵罐内酵母菌体浓度

X2=X02·D2/（D2-μ2）..........................................................26

将26式重排列，则：

X2=（D2-μ2）X02+μ2X02/（D2-μ2）

=X02+μ2/（D2-μ2）·X02........................................................27

27式说明当X02酵母浓度加入第二级发酵罐进行连续发酵时，不会从该发酵罐内流出过量的菌体，因为X02、μ2和D2是大于零，并且D2＞μ2，按照26式可见X2＞X02。

③ 如果两级连续发酵过程中已经知道μ1、μ2、X1、X2和D2等参数的数值便可以根据23、24式计算，第一级发酵罐体积V1和第二级发酵罐体积V2之间的关系。

将24式重排可变为：

（F1+F02）/V2·X02+μ2X2=D2·X2..........................................................................28

用23式代入28式，则：

（F1+F02）/V2·F1/（F1+F02）·X1+μ2·X2－D2·X2=0....................................29

简化为F1/V2·X1+μ2·X2－D2·X2=0..................................................30

由于F1/V2=D1=μ1

则：F1＝μ1·V1

因此30式可以再改写为

μ1·X1·V1／V2＋μ2·X2－D2·X2=0....................................................31

31式是在上述参数己知时，第一级发酵罐体积和第二级发酵罐体积之间的基本关系式，将此式改写可得到：

V1＝X2·（D2-μ2）/μ1·X1·V2......................................................32

V2＝μ1·X1／X2·（D2-μ2）·V1.....................................................33

32式及33式说明了发酵罐体积或者对数生长速度、稀释度和酵母菌体浓度之间的关系，由公式还说明加入第二级发酵罐的发酵醪，是否通过第一级发酵罐，或者是接着就加入第二级发酵罐，是无关重要的，这意味着，当以第一线发酵罐中作为酒母接种罐在一定基质条件下，真正的连续发酵过程仅在第二级发酵罐中发生。

④ 为了全面分析问题，我们考察一下第二级发酵罐内基质浓度为S02，假定S02内以下经验公式得到：

则：S02=（F1S1+F02Sa）/F2....................................................34

假如Sa是F02中的基质浓度，在第二级发酵罐内基质浓度是S2，在产量常数K时基质消耗是与菌体生长成比例。

即基质消耗量=μ2X2／K　

因此在动态平HENG 衡状态时可写为

流入-流出-消耗＝0

D2·S02－D2·S2－μ2·X2／K=0......................................................35

在第二级发酵罐内甚质减少▲S为：

▲S＝S02－S2＝μ2·X2／D2·K.....................................................36

在第二级发酵罐中基质浓度是：

S2＝S02－μ2X2／D2K...........................................................37

将24式中的μ2代入，在己知酵母菌体产量K和已知流入成分S02时，便得到基质浓度与酵母菌体浓度之间的关系。

S2=S02-(X2-X02)/K...........................................................38

将38式重排可得：

X2=K(S02-S2)+X02............................................................39

假如要了解处于动态平衡状态的第二级发酵罐中的条件，可通过分批发酵得到μmax,Ks和K等数值以及测得第一级罐的条件，如X1、D1、S1及V1等数值，再通过上述公式运算便可求到第二级发酵罐的其它条件，如果新鲜基质是加入第二级发酵罐内，它的浓度Sa和流速F02也必须知道。

(3)将上述公式可推广到有任意级数发酵罐的多级连续发酵过程中，求得第n级发酵罐的各数值。

① 如求Vn按33式为：

Vn=μn-1· Xn-1／Xn·(Dn－μn)Vn-1...............................................40

② 求稀释度Dn可按25式

Dn＝μnXn/(Xn－x0n)..........................................................41

③ 求第n级发酵罐中的基质浓度为：

Sn＝S0n(Xn－X0n)／K.........................................................42

④ 求酵母菌体浓度为：

Xn＝K(Son－Sn)十X0n.........................................................43

假如基质仅从第一级发酵罐中加入，也就是在所有发酵罐中加料都是相同的

则：Xon＝Xn-1

Son＝Sn-1

(4)设计多级连续发酵的图解法

①除了上述数学推导外，为求得多级连续发酵的各生产参数，还可以采用作图法。如果假定在连续发酵中任何一级发酵罐酵母菌体数处于动态平衡状态时，加基质都从第一级发酵罐加入，则应服从下式平衡状态：

流入十生长＝流出

FXn-1+V·dXn/dt＝FXn.........................................................44

将44式重排便得到下式：

dXn/dt=F/V(Xn-xn-1)........................................................45

②公式45是用作图法求得多级连续发酵各参数的基本公式，可以直接用糖蜜酒精间歇发酵的数据，构成一条细胞生长速率dx/dt对应于酵母菌体浓度x作图所得的曲线，即为多级连续发酵的反应曲线，见图2-5。

③多级连续发酵的反应曲线是以abc表示，连续发酵的第一个发酵罐的X1值可用图解法决定，斜率为F／V的直线与曲线abc的交点即为X1值，按这样的程序重复作图，可继续求得X2，X3，如图2-5所示。

如果需要求得一个连续发酵过程的最大生产能力，则应选择第一级发酵罐的酵母菌体浓度，使之为dx/dt曲线的最高点a,即酵母菌体最大增殖点。根据物料平衡原则，第二级发酵罐或以后

各级发酵罐的酵母菌体浓度也可求得。